Metodická zaškolení Student bude mít možnost absolvovat libovolnou kombinaci, vybranou po dohodě se svým školitelem v termínu, sjednaném s vedoucím laboratoře, kde bude zaškolení probíhat. Membránové mikrodomény – izolace a funkce (Petr Dráber, ÚMG). Izolace membránových mikrodomén ultracentrifugací na hustotních gradientech. Vizualizace komponent membránových mikrodomén pomocí protilátek. Charakterizace komponent membránových mikrodomén po jejich imunoprecipitaci – enzymatické testy. Semliki forest virus jako nástroj studia prostorové organizace molekul receptorové signalizace (Petr Dráber, ÚMG). Příprava virových vektorů s GFP. Infekce cílových buněk. Charakterizace transfektant pomocí imunochemických a mikroskopických technik. Žírné buňky – model studia membránové signalizace (Petr Dráber, ÚMG). Buňky se vyznačují významnou, rychlou a snadno měřitelnou odpovědí (sekrece) na aktivační signál – vazba alergenu na komplex IgE s membránovým receptorem. Během minut dochází k uvolnění sekretorických mediátorů alergických reakcí. Problém se získáním většího množství buněk pro biochemická studia je řešen kultivací buněk kostní dřeně v přítomnosti interleukinu 3. Celogenomové mapování pomocí mikrosatelitových DNA markerů (Jiří Forejt, ÚMG). Příprava genomové DNA, výběr markerů, PCR amplifikace, identifikace alelických forem, mapování. Analýza genové exprese pomocí kvantitativní RT PCR v reálném čase (Jiří Forejt, ÚMG). Prezentace firmy ROCHE (event. Applera, Biotech apod) a následné koreferáty doktorandů s vlastními zkušenostmi s real-time PCR. In vitro vazebný test spermií na zona pellucida vajíčka (Jana Pěknicová, ÚMG). Kapacitované spermie jsou inkubované s monoklonální protilátkou proti proteinům spermie a počet navázaných spermií na zona pellucida vajíčka (značení pomocí Hoechst 33342) je porovnán s počtem navázaných spermií u kontrolní skupiny. Pokud dochází k inhibici vazby spermií na vajíčko proti neovlivněné kontrole, je prokázána fysiologická úloha daného proteinu spermie v primární nebo sekundární vazbě na vajíčko. Hodnocení patologie spermií savců (Jana Pěknicová, ÚMG). Monoklonální protilátky proti proteinům spermie je možné použít ve fluorescenčním testu k diferenciální diagnostice patologie spermií, k výběru optimální metody v asistované reprodukci a ke kontrole spermatogenese (veterinární praxe, IVF laboratoře – lidská medicína). Technika mikropreparace a histochemie v embryologii (Richard Jelínek, 3. LF UK). Studenti budou vybaveni základními znalostmi a dovednostmi pro práci s jemnými strukturovanými objekty vyšší biologické organizace. Výuka: technika mikropreparace a běžné metody histologického a histochemického zpracování. Základním objektem bude zárodek kuřete. Ultrastrukturální imunocytochemie (Pavel Hozák, ÚEM). Procvičena bude kompletní příprava tkáně pro ultrastrukturální vyšetření pomocí imunocytochemie. Fixace, odvodnění, typy zalévacích médií, polymerizace, krájení, značení pomocí koloidního zlata. Statistické zjišťování seskupování (clustering) a kolokalizace antigenů. Práce s proteinovými megakomplexy (Zdeněk Hodný, ÚEM). Náplní dvoudenního kurzu bude teoretický úvod a praktická demonstrace elektroforetické techniky umožňující separovat buněčné proteinové komplexy v nativním stavu pomocí nativní BN PAGE s cílem následné identifikace jejich složení pomocí imunodetekce a hmotnostní spektrometrie. Izoelektrická fokusace a 2D elektroforéza (Zdeněk Hodný, ÚEM). Cílem dvoudenního praktického kurzu bude demonstrovat praktickou přípravu gelů pro isoelektrickou fokusaci s immobilizovaným pH gradientem o různém rozsahu a základní techniku 2D elektroforézy s detekcí barvení stříbrem pro hmotnostní spektrometrii. Proteomika - hmotnostně spektrometrická identifikace proteinů (Vladimír Havlíček, MBÚ). Peptidové mapovaní, peptidové sekvenování, de novo sekvenování (praktický kurz pro omezený počet 2-5 frekventantů/kurz). Konfokální a dvoufotonová mikroskopie (Lucie Kubínová, FgÚ). Princip, předvedení mikroskopu, praktické ukázky na vzorových i přinesených vzorcích, ukázky analýzy nasnímaných dat. Stereologické metody v biomedicíně (Lucie Kubínová, FgÚ). Stereologické metody pro měření objemu, povrchu, délky a počtu. Vzorkování ve stereologii. Charakteristiky 2. řádu pro hodnocení prostorového uspořádání struktur, příklady. Analýza obrazu a trojrozměrné rekonstrukce (Lucie Kubínová, FgÚ). Filtrace a segmentace obrazových dat nasnímaných mikroskopem. Automatické měření objemu, počtu, povrchu a délky. Dekonvoluce. Vizualizace: objemové a povrchové rekonstrukce. Imunofluorescenční detekce cytoskeletálních struktur v buňkách eukaryot (Pavla Binarová, MBÚ a Pavel Dráber, ÚMG). Extrakce a fixace buněk při zachování cytoskeletálních struktur, značení pomocí specifických protilátek nebo značených sond, násobná značení v buňkách od nižších rostlin po člověka. Konstrukce hybridomu a charakterizace monoklonálních protilátek (Pavel Dráber, ÚMG). Imunizace, fúze, selekce hybridomu, reklonace, imunochemická charakterizace protilátek. Práce s Xenopus laevis, in vitro fertilizace oocytů (Jiří Jonák, ÚMG). Příprava žab ke snášení oocytů, příprava spermií z varlat, in vitro fertilizace, stadia vývoje. Transgeneze Xenopus laevis (Jiří Jonák, ÚMG). Mikroinjekce plasmidové DNA do jednobuněčných embryí: příprava plasmidu s GFP, mikroinjektáž, detekce transgenní DNA a její exprese (PCR, fluorescenční mikroskopie). Příprava rekombinantních proteinů pomocí fúze s GST (Jiří Jonák, ÚMG). Klonovaní genu pro žádanou bílkovinu do plasmidů pGEX, transformace E. coli, indukce exprese fuzního produktu GST-bílkovina, purifikace, odštěpení GST a získání čisté bílkoviny. Práce se savčími oocyty a embryi in vitro (Jan Motlík a Jiří Kaňka, ÚFGŽ). Zrání savčích oocytů, jejich oplození a kultivace embryí v podmínkách in vitro. Přenos jader a preimplantační vývoj savčího embrya (Jan Motlík a Jiří Kaňka, ÚFGŽ). Samičí zárodečná buňka - oocyt ve stadiu metafáze druhého meiotického dělení je jediným zdrojem cytoplastů pro všechny pokusy spojené s přenosem jader. Preimplantační vývoj savčího embrya představuje jedinečný model pro studium aktivace embryonálního genomu. Doplněno bude metodikami pro vyšetření oocytů a embryí ve fázovém kontrastu, biochemicky (imunoblot, kinázove testy) a molekulárními (RT-PCR). zpět do menu..